現(xiàn)代液相色譜中，分離效果好壞的一個重要指標(biāo)是色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，因此，要做合適的選擇，必須對此有一定的認(rèn)識和了解。
    一、硅膠基質(zhì)填料 
    1、正相色譜。正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2，APS）和氰基團（CN，CPS）的鍵合相填料。
    由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其他極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份zui先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
    2、反向色譜。反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分zui先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。
    常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
    二、聚合物填料。聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要優(yōu)點是在PH值為1—14均可使用。相對于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效?，F(xiàn)有的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
    三、其它無機填料。其它HPLC的無機填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì)，一般于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體，由于在HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可以在PH高達12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強，應(yīng)用范圍受到一定限制，所以未能廣泛應(yīng)用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH1-14，溫度可達100℃。由于氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進行之中。
    怎樣選擇填料粒度。目前，商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5um填料進行。填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是*的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數(shù)或分離能力，但是柱長更短，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。 

色譜柱維護 
（1）防止色譜柱堵塞 
原因1：溶劑中的不溶物 
 — 應(yīng)使用色譜純?nèi)軇?，膜過濾（孔徑不超過0.45μm） 
原因2：樣品中的不溶物 
 — 應(yīng)對樣品進行膜過濾（孔徑不超過0.45μm） 
原因3：泵，進樣器等中的不溶物 
—  在泵和進樣器之間安裝內(nèi)置過濾器，在進樣器和柱之間安裝預(yù)過濾器 
原因4：柱內(nèi)不溶物的形成 
4-1．由于溶劑的不互溶而產(chǎn)生的沉淀 
—用能溶解沉淀物的溶劑沖洗色譜柱 
4-2．在不互溶溶劑中由于進樣而產(chǎn)生的沉淀 
    —檢查樣品液和流動相是否互溶 
4-3．由于溫度的改變或固定相的干涸而產(chǎn)生的沉淀 
—將色譜柱密封緊，并保持室溫恒定 
操作壓力上升故障排除 
HPLC系統(tǒng)流程圖： 
吸入過濾器>>泵>>內(nèi)置過濾器>>進樣器>>預(yù)過濾器>>保護柱>>主分析柱>>檢測器 
和排放系統(tǒng) 
從流程圖的末端依次斷開部件，如從檢測器開始斷開，zui容易引起阻塞的部件是： 
預(yù)過濾器，保護柱和主分析柱 。
[注]：應(yīng)記錄新柱子在常規(guī)分析條件下的操作壓力 
（2）柱堵塞的修復(fù) 
步驟1：使用含鹽緩沖液后（如離子對試劑）應(yīng)用溶解性強的溶劑（如水）進行沖 
洗 ；
步驟2：先斷開檢測器，然后用對來自樣品中的物質(zhì)有強溶解性的溶劑進行沖洗。 
對于反相色譜柱，可使用甲醇，乙睛，四氫呋喃，氯仿，庚烷等，在此條件下，應(yīng) 
避免溶劑的pH低于2或高于8；
若經(jīng)過步驟1和步驟2后，壓力仍沒下降至步驟3 ；
步驟3：斷開檢測器，將色譜柱反方向放置，然后檢查柱壓 
1）若壓力穩(wěn)定下降，至步驟4 

2）若壓力不下降，至步驟5 
步驟4：保持色譜柱反方向連接，用低于0.5 ml/min 流速沖洗1小時 
若步驟4不能降壓，至步驟5 ；
步驟5：若內(nèi)置過濾器被堵塞，應(yīng)沖洗或更換。柱連接端的拆卸或重裝會導(dǎo)致柱效 
下降，（有效塔板數(shù)下降和不對稱峰），若步驟5不能降低柱壓，至步驟6 
步驟6：若進口端的填料發(fā)生堵塞，柱子將不可能被*恢復(fù)，只能通過去掉進口 
端的部分填料，重新填充進行有限的柱效恢復(fù)。（2~5mm） ；
[注]：在多數(shù)情況下，柱效將嚴(yán)重地下降 
步驟7：若步驟6無法改善柱子性能，那么柱子已無法修復(fù)，請注意當(dāng)拆開連接端時 
柱子已不再得到質(zhì)量保證。 
柱效的下降：
導(dǎo)致柱有效塔板數(shù)和分離能力下降的主要原因是固定相的惡化和硅膠表面活性鏈的 
損失，在這些條件下柱子已不可能再恢復(fù)

色譜柱的使用

1、色譜柱的使用說明： 
　?。?）色譜柱使用前注意事項：色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相。在使用前，一定要注意色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應(yīng)先用10％左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出，堵塞色譜柱。
　　（2）流動相：流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動相再經(jīng)過0.45μm的濾膜過濾一次則zui好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應(yīng)該定期清洗或更換。
　　以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的PH值適用范圍是2.0-8.0，BDS C18適合于堿性化合物，PH值適用范圍為2.0-10.0。當(dāng)必須要在PH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗，并*置換掉原來所使用的流動相。
　?。?）樣品：樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處理柱（SPE）對樣品進行預(yù)處理；若樣品不便處理，要使用保護柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫水。
　　2、色譜柱的保存 
　?。?）反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。
　?。?）長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑*或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度是室溫。
　　3、色譜柱的再生 
　　因為色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數(shù)的增加，會出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來說可能是柱效下降。
　?。?）反相柱的再生：依次采用20-30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。
　?。?）正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。
　　4、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法 
　　色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬于正?，F(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），以下列舉了部分常見原因及解決辦法：
　?。?）色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；
　　解決方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。
　?。?）色譜柱頭的填料被樣品污染；
　　解決方法：如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。
　?。?）色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結(jié)晶析出； 解決方法：如確定定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。
　?。?）流動相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。解決方法：如果因PH值使用不當(dāng)，很難恢復(fù) 液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關(guān)鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。
　　一、液相色譜柱的安裝：
　　1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：
　　a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
　　柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸外螺紋，另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接，中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在2．5mm長或其他固定尺寸)。
　　在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網(wǎng))，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失。空柱各組件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
　　b、柱填料：
　　液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
　　正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10
μm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。
　　反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
　　常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。
　　2、色譜柱的安裝：
　　a、拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
　　b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
　　c、 按柱管上標(biāo)示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護柱)；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，再用扳手繼續(xù)順時針擰1/4-1/2圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰1/4圈，直至不漏液為止。
　　二、液相色譜柱的使用：
　　色譜柱在使用前，進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是*條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。
　　1、樣品的前處理：
　　a、使用流動相溶解樣品。
　　b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
　　c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
　　2、流動相的配制：
　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
　　a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
　　b、流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
　　c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
　　d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
　　e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行。
　　f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
　　3、流動相流速的選擇：
　　因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。
　　當(dāng)選用*流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
　　注意：
　　a．由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
　　b．對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。
　　c．含水流動相zui奸在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要隔夜。加入*，防止細菌生長。
　　d．流動相要求使用0.45 μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。
　　e．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
　　4、柱性能測試：
　　啟動液相色譜儀：a、流動相流速設(shè)定為1ml/min。
　　b、UV檢測器波長設(shè)定為254nm。
　　使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。
　　記錄并計算測試結(jié)果。

2、色譜柱的保存 

（1）反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：

使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。

（2）長期保存色譜柱：

如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑*或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度是室溫。

3、色譜柱的再生  

因為色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數(shù)的增加，會出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來說可能是柱效下降。

（1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。

（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。

4、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法 

色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬于正?，F(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點：

（1）色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；

（2）色譜柱頭的填料被樣品污染；

（3）色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結(jié)晶析出；

（4）流動相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。

解決辦法如下：

（1）如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。

（2）如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。

（3）如確定定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。

（4）如果因PH值使用不當(dāng)，很難恢復(fù)。