外泌體制備，便宜又好用的方法

外泌小體（Exosome）是一種囊泡結(jié)構(gòu)，直徑通常在30-150nm，常見于正常體液和病理樣本，培養(yǎng)細胞也可分泌。研究人員已經(jīng)在血液、唾液、尿液、母乳等中發(fā)現(xiàn)外泌小體，其運載的蛋白和核酸涉及其細胞間物資、信息交流，影響和調(diào)控著多方面的生理功能，包括腫瘤發(fā)生、免疫促進、凋亡調(diào)控、血管生成、炎癥反應(yīng)及發(fā)育和分化 等。由于在體液中出現(xiàn)，外泌小體對于臨床生物標志物檢測特別有 利，成為體外診斷、biomarker研究的新熱點。

近年來隨著分離純化技術(shù)的提高，關(guān)于外泌小體的研究成果頗豐；這進一步吸引了越來越多領(lǐng)域的課題將外泌體納入研究對象。研究的前提是方便、高效、標準化地分離純化外泌小體。經(jīng)過近20年的探索，已經(jīng)建立了超速離心法、沉淀法、色譜法、親和純化法等。在大量實踐中大家逐漸認識到根據(jù)下游研究對樣品的要求，以及起始樣品的規(guī)模、數(shù)量，可以選擇不同的外泌體制備策略。因不需要特殊的設(shè)備和試劑盒，對操作人員也沒有特別的經(jīng)驗要求，超濾法成為實驗室中制備外泌體的通用方法。

參考方案

兩步法細胞上清的外泌體分離

超濾方法純化具體操作步驟舉例

Amicon® Ultra-15 超濾管 (10 kDa MWCO)

● 用Steriflip真空抽濾對樣品進行澄清[目錄號 SCGPO0525; 0.22um Millipore Express PLUS (PES)膜]

● 用PBS平衡Amicon Ultra-15超濾管( 目錄號UFC901096，10kDa) ，離心 4000g X 10 min。

● 從超濾管內(nèi)管及收集管吸走 PBS。

● 向超濾管加入15mL 樣品。

●  4000g 離心30min.濃縮。

●  倒空收集管。

●  加入14 mL PBS進行緩沖液置換，溫柔吸打樣品數(shù)次。

●  4000g離心30 min。

●  從濃縮管吸回處理好的樣品。(30X 濃縮)

注意: 所有 Amicon  ultra 超濾管(0.5,2,4 和15 mL)與此操作流程兼容*

注意事項及補充提示

● 無血清樣品選擇 3kDa 孔徑是為了盡可能提高外泌體的回收率。

● 有血清樣品選擇 100kDa/500kDa 孔徑是為了盡可能去除細胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌體的白蛋白造成的影響。

● 研究者可根據(jù)樣品的粘稠程度，以及需要制備的目標外泌體 / 囊泡 / 顆粒的大小分布來選擇和優(yōu)化超濾孔徑(3kDa/ 10kDa/ 30kDa/ 50kDa/ 100kDa)，以便達到更好的得率和操作體驗。

● 樣品體積大于 30mL 時可以考慮用超濾杯或 Centricon plus -70 超管，請注意攪拌式超濾杯在 200mL 以內(nèi)時吸附損

耗可能較離心式超濾管略偏高。

● 如需進一步提高特定外泌體的純度，可選用包被相應(yīng)抗體的磁珠進行親和純化精制。

不同方法制備外泌小體產(chǎn)量比較

超濾法制備的外泌小體參考數(shù)據(jù)

多維度分析4 個SH-SY-5Y 細胞系的外泌小體樣品

(含或不含血清)

默克生命科學(xué)過濾超濾產(chǎn)品組合